彈性蛋白(Elastin)是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，其降解水平與肺氣腫、動脈粥樣硬化、皮膚老化等多種病理生理過程密切相關(guān)。目前，ELISA法因其高靈敏度和可重復(fù)性，成為定量檢測樣本中彈性蛋白或其降解片段(如ELM、desmosine)的主流方法。以下以常見的彈性蛋白檢測試劑盒為例，詳解標(biāo)準(zhǔn)操作流程。
 

　　一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
 

　　樣本類型確認(rèn)：常見樣本包括血清、血漿(EDTA或肝素抗凝)、細(xì)胞培養(yǎng)上清或組織勻漿液。避免反復(fù)凍融，建議分裝后–80℃保存。
 

　　試劑回溫：將試劑盒從冰箱取出，室溫(20–25℃)平衡30分鐘，防止冷凝水影響反應(yīng)。
 

　　標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶：按說明書用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液精確復(fù)溶凍干標(biāo)準(zhǔn)品，再進(jìn)行梯度稀釋(通常為2倍或3倍系列)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(如0、15.6、31.25…1000 ng/mL)。
 

　　二、加樣與孵育
 

　　加樣：向預(yù)包被抗體的96孔板中加入50–100μL標(biāo)準(zhǔn)品、空白對照及待測樣本(必要時預(yù)稀釋)。每組設(shè)復(fù)孔以減少誤差。
 

　　第一次孵育：37℃孵育60–90分鐘，使彈性蛋白抗原與捕獲抗體結(jié)合。
 

　　洗板：棄去液體，用1×洗液洗滌3–5次，每次30秒，拍干殘留液體(避免交叉污染)。
 

　　三、檢測抗體與顯色
 

　　加酶標(biāo)抗體：加入100μL生物素化或HRP標(biāo)記的檢測抗體，37℃孵育30–60分鐘。
 

　　再次洗板：徹底清洗未結(jié)合抗體。
 

　　加顯色底物：加入TMB等顯色液，避光室溫反應(yīng)10–15分鐘(時間依信號強(qiáng)度調(diào)整)。
 

　　終止反應(yīng)：加入50μL 2M H?SO?終止液，溶液由藍(lán)變黃。
 

　　四、讀數(shù)與數(shù)據(jù)分析
 

　　使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(參考波長630 nm)測定吸光度(OD值)。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)繪制擬合曲線(通常為四參數(shù)邏輯曲線)，計算樣本中彈性蛋白濃度，并乘以稀釋倍數(shù)。
 

　　注意事項(xiàng)：
 

　　避免樣本溶血或脂血，可能干擾檢測；
 

　　不同批次試劑盒不可混用；
 

　　若樣本濃度過高，需進(jìn)一步稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)。
 

　　規(guī)范操作是獲得可靠數(shù)據(jù)的前提。掌握上述流程，可顯著提升彈性蛋白檢測的準(zhǔn)確性與可重復(fù)性。